www.biology4u.gr

Με την αλματώδη ανάπτυξη της επιστήμης της γενετικής του ανθρώπου τις τελευταίες δεκαετίες και συγκεκριμένα μέσα από τις γνώσεις μας για τη φύση και τη λειτουργία των γονιδίων στη φυσιολογική και την μη-φυσιολογική (μεταλλαγμένη) κατάσταση τους και τη συσχέτιση τους με ασθένειες του ανθρώπου, οδηγηθήκαμε στην εξαιρετικά απλή, ως σύλληψη, ιδέα της θεραπείας με παρέμβαση στο γενετικό υλικό, δηλαδή στη γονιδιακή θεραπεία. Συγχρόνως, η εμφάνιση της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA με κεντρικό παράγοντα την κλωνοποίηση γονιδίων, έδωσε ρεαλιστική προοπτική στην ιδέα αυτή.

1.Τι είναι η Γονιδιακή Θεραπεία;

Κατ’αρχάς, δεν είναι ακόμα θεραπεία, με την έννοια ότι δεν υπάρχει ακόμα, σε κανένα μέρος του κόσμου, το ενδεχόμενο να εισαχθεί κάποιος ασθενής σε νοσοκομείο και οι γιατροί να συνταγογραφήσουν γονιδιακή θεραπεία, όπως κάνουν π.χ. για μια εγχείρηση. Όλοι όσοι έχουν υποβληθεί σε μια κάποια μορφή γονιδιακής θεραπείας έχουν στην πραγματικότητα επιλεγεί με συγκεκριμένα κριτήρια για να συμμετάσχουν, σε εθελοντική βάση, σε ένα πρόγραμμα κλινικής δοκιμής για την ασθένεια τους. Μερικοί από αυτούς τους ασθενείς έχουν πράγματι θεραπευθεί, αλλά αυτό δεν αναιρεί το γεγονός ότι η Γονιδιακή Θεραπεία (Γ.Θ.) είναι ακόμα σε πειραματικό στάδιο. Επομένως η Γ.Θ. σήμερα είναι ακόμα έρευνα σε βασικό και σε κλινικό επίπεδο. Η Γ.Θ. στοχεύει στην αναίρεση ενός παθολογικού φαινοτύπου και στην αποκατάσταση του φυσιολογικού, με μια διεργασία η οποία περιλαμβάνει οπωσδήποτε μεταφορά γενετικού υλικού στα κύτταρα του ιστού που πάσχει. Το ποιο γενετικό υλικό μεταφέρεται, σε ποια ακριβώς κύτταρα και με ποιόν τρόπο εξαρτάται από τη γενετική βάση της ασθένειας, την παθοφυσιολογία της ασθένειας, και τη διαθέσιμη τεχνολογία γονιδιακής μεταφοράς.

2. Ποιες ασθένειες αφορά;

Η Γ.Θ. αφορά όλες τις ασθένειες στις οποίες εμπλέκεται το γενετικό υλικό του ανθρώπου η λοιμωδών παραγόντων του ανθρώπου. Οι ασθένειες αυτές μπορεί να είναι κληρονομικές (μονογονιδιακές ασθένειες μενδελικής κληρονομικότητας) η μη-κληρονομικές, γενετικές ασθένειες (καρκίνος) ακόμα και πολυπαραγοντικές ασθένειες (νόσος Parkinson), αλλά σε κάθε περίπτωση η γονιδιακή μεταφορά γίνεται σε σωματικά κύτταρα. Στην περίπτωση των λοιμωδών νοσημάτων στόχος της γονιδιακής μεταφοράς είναι η δημιουργία εμβολίων ενδοκυτταρικά.

3.Στρατηγικές Γονιδιακής Θεραπείας

Α.Στρατηγικές που αφορούν στο γονίδιο που εμπλέκεται στη νόσο

Ι.Μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου (κλασική γονιδιακή θεραπεία) ‘’gene addition”, “gene replacement”, “gene augmentation”

Αρχικά επιχειρήθηκε η διόρθωση της πρωταρχικής βλάβης, δηλαδή της μετάλλαξης σε ένα γονίδιο που ευθύνεται για την ασθένεια, με τη μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου στα κατάλληλα κύτταρα του ασθενούς, με τρόπο ώστε το φυσιολογικό αλληλόμορφο να αντικαταστήσει το μεταλλαγμένο στο ενδογενές γενετικό υλικό, με ομόλογο ανασυνδυασμό, ενα σπάνιο φαινόμενο που συμβαίνει φυσιολογικά στα κύτταρα. Σύντομα έγινε φανερό ότι ο ομόλογος ανασυνδυασμός και σε αυτές τις πειραματικές συνθήκες εξακολουθεί να είναι σπάνιος και άρα, αναποτελεσματικός για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας. Επί πλέον σε περιπτώσεις μεγάλων γονιδίων με μεγάλο αριθμό διαφορετικών μεταλλάξεων (πχ κυστική ίνωση) αυτή η προσέγγιση δεν προσφέρεται. Σήμερα, η μεταφορά του φυσιολογικού γονιδίου στα πλαίσια της γονιδιακής θεραπείας νοείται μόνο ως προσθήκη του φυσιολογικού γονιδίου στα κύτταρα που πάσχουν, ενώ είναι παρόν και το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Η στρατηγική αυτή αφορά συνήθως σε μονογονιδιακές υπολειπόμενες ασθένειες , όπως η κυστική ίνωση, η δρεπανοκυτταρική αναιμία, οι θαλασσαιμίες κλπ. Επίσης αφορά σε μονογονιδιακές επικρατείς ασθένειες, που οφείλονται σε έλλειψη μιάς πρωτεΐνης, όπως πχ η έλλειψη του υποδοχέα της LDL στην οικογενή υπερχοληστερολαιμία. Γενικά αφορά περιπτώσεις γενετικών ασθενειών οι οποίες είναι απόρροια μεταλλάξεων που επιφέρουν ελάττωση η απώλεια της λειτουργίας μιας πρωτεΐνης στο κύτταρο (loss-of-function).

ΙΙ. Αναστολή της έκφρασης ενός γονιδίου (“gene knock down”)

Η στρατηγική αυτή στοχεύει στην αναστολή της έκφρασης ενός γονιδίου του οποίου το προϊόν είναι επιβλαβές για το κύτταρο και προσφέρεται σε περιπτώσεις : (ι) νοσημάτων που οφείλονται σε μεταλλάξεις υπεύθυνες για την παραγωγή μιας πρωτεΐνης με αλλαγή στη λειτουργία της (πχ αιμοσφαιρινοπάθειες που οφείλονται σε αιμοσφαιρίνη με αυξημένη η ελαττωμένη ικανότητα πρόσδεσης Ο2. Αφορά συνήθως επικρατείς κληρονομικές ασθένειες με μεταλλάξεις που προκαλούν τροποποίηση της λειτουργίας μιας πρωτεΐνης (gain-of-function). (ιι) κακοηθειών που οφείλονται στην υπερέκφραση πρωτο-ογκογονιδίων ή στην έκφραση μη φυσιολογικών πρωτεϊνών εκ σύντηξης (π.χ.bcr-abl στη χρόνια μυελογενή λευχαιμία) Η αναστολή της έκφρασης και στις δύο περιπτώσεις μπορεί να επιτευχθεί μέσω μεταφοράς αντι-νοηματικών (anti-sense) ολιγονουκλεοτιδίων, siRNAs (small interfering RNAs) ή ριβοενζύμων.

ΙΙΙ. Διόρθωση μεταλλάξεων in-situ (genome editing)

Η στρατηγική αυτή αφορά στη διόρθωση μεταλλάξεων μέσω τροποποίησης του γονοτύπου και αφορά σε όλες τις περιπτώσεις ασθενειών που αναφέρονται στις παραγράφους ΑΙ και ΑΙΙ. Πρόκειται για μια νεότερη προσέγγιση που περιλαμβάνει τη χρήση νουκλεασών με δομή δακτύλων ψευδαργύρου (zinc-finger nucleases, ZFNs), οι οποίες προκαλούν στοχευμένη θραύση της αλυσίδας του DNA στη θέση της μετάλλαξης. Στη συνέχεια, μηχανισμοί του κυττάρου επιδιορθώνουν τη θραύση μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, χρησιμοποιώντας ως μήτρα το φυσιολογικό αλληλόμορφο, το οποίο ομοίως παρέχεται εξωγενώς. Έτσι προκαλείται ομόλογος ανασυνδυασμός σε συχνότητα ικανή για να έχει θεραπευτική αξία.

Β. Στρατηγικές μεταφοράς γονιδίου που δεν εμπλέκεται στη νόσο

Ι. Μεταφορά ενός γονιδίου που φυσιολογικά δεν εκφράζεται στα συγκεκριμένα κύτταρα.

Η στρατηγική αυτή συνήθως χρησιμοποιείται για τη στόχευση καρκινικών κυττάρων με σκοπό τη θανάτωσή τους, μέσω της μεταφοράς γονιδίου που κωδικοποιεί μια τοξίνη ή μια πρωτεΐνη της οποίας η έκφραση καθιστά τα κύτταρα ευαίσθητα στη δράση ενός προ-φαρμάκου.

ΙΙ.Μεταφορά τεχνητών μεταγραφικών παραγόντων

Η προσέγγιση αυτή αφορά στην ανάπτυξη τεχνητών μεταγραφικών παραγόντων, στοχευμένων προς συγκεκριμένες περιοχές του DNA (υποκινητή γονιδίου) η μεταφορά των οποίων στα κατάλληλα κύτταρα έχει ως συνέπεια την ενεργοποίηση του εν λόγω γονιδίου, για θεραπευτικούς σκοπούς. Τέτοια είναι η περίπτωση της ανάπτυξης τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα για την ενεργοποίηση in trans του γονιδίου της γ σφαιρίνης με σκοπό τη θεραπεία της β θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας.

Γ. Στρατηγικές εξατομικευμένων προσεγγίσεων

Εκτός από τις παραπάνω στρατηγικές που αφορούν ομάδες νοσημάτων, τελευταία πολλές νέες, εναλλακτικές προσεγγίσεις βρίσκονται σε ανάπτυξη, διότι κάθε νόσημα έχει τις δικές του ιδιαιτερότητες, από τις οποίες προκύπτει η ανάγκη ανάπτυξης εξατομικευμένων στρατηγικών γονιδιακής θεραπείας, για πολλά από αυτά. Αξίζει να αναφερθεί η στρατηγική “exon skipping” για τη γονιδιακή θεραπεία της μυϊκής δυστροφίας Duchenne. Με την στρατηγική αυτή το εμπλεκόμενο γονίδιο μεταπίπτει στη δομή της μυϊκής δυστροφίας Becker, μια πολύ πιο ήπια μορφή της ασθένειας.

4. Γονιδιακή Μεταφορά

Το γενετικό υλικό (γονίδιο η άλλη αλληλουχία του DNA) που μεταφέρεται κάθε φορά στο πλαίσιο της γονιδιακής θεραπείας, το λεγόμενο διαγονίδιο, συνοδεύεται πάντα από τα στοιχεία του DNA που θα του επιτρέψουν την έκφραση του στο κύτταρο υποδοχής και μάλιστα, συνήθως με τρόπο ελεγχόμενο. Έτσι το σύστημα που μεταφέρεται είναι στην πραγματικότητα μία «μεταγραφική, θεραπευτική κασσέττα». Η γονιδιακή μεταφορά πρέπει να εξασφαλίζει δύο συνθήκες: Πρώτον, τη μεταφορά αυτή καθαυτή, δηλαδή να δίνει τη δυνατότητα στη μεταφερόμενη μεταγραφική, θεραπευτική κασσέττα να εισέλθει στα κατάλληλα κύτταρα και μάλιστα στον πυρήνα αυτών των κυττάρων, (μεταφορά). Δεύτερον, πρέπει αυτή η μεταγραφική, θεραπευτική κασσέττα, μολονότι είναι εξωγενές γενετικό υλικό, να παραμένει στα κύτταρα και να μεταβιβάζεται στα θυγατρικά κύτταρα (συγκράτηση και μεταβίβαση). Η γονιδιακή μεταφορά διαμεσολαβείται από ιϊκα και μη-ιϊκά συστήματα-φορείς. Τα ιϊκά συστήματα-φορείς ικανοποιούν και τις δύο αυτές συνθήκες. Τα μη ιϊκά συστήματα-φορείς αφορούν φυσικές η χημικές μεθόδους μεταφοράς της θεραπευτικής κασσέττας για τη πρώτη συνθήκη και δομή της κασσέττας που να της επιτρέπει να παραμένει στο κύτταρο είτε ενσωματούμενη στο ενδογενές γενετικό υλικό είτε ως ελεύθερο επίσωμα. Η κάθε κατηγορία φορέων παρουσιάζει ιδιαίτερα προβλήματα. Σήμερα, το σημαντικότερο πρόβλημα των ιϊκών φορέων που είναι ικανοί να πάρουν ικανό φορτίο ως προς το διαγονίδιο, είναι το ότι ενσωματώνονται συνήθως σε τυχαίες θέσεις στο ενδογενές γενετικό υλικό των κυττάρων. Αυτό μπορεί να έχει σοβαρές συνέπειες για την λειτουργία παρακείμενων γονιδίων. Από την άλλη μεριά, το σημαντικότερο πρόβλημα των μη-ιϊκών επισωματκών φορέων είναι το ότι έχουν χαμηλή συγκράτηση στο κύτταρο που μεταφέρονται. Είναι φανερό ότι η μεγαλύτερη ερευνητική επένδυση σήμερα στη γονιδιακή θεραπεία γίνεται για την μελέτη και την ανάπτυξη φορέων γονιδιακής μεταφοράς με ασφάλεια και ικανοποιητική επάρκεια.

5. Κλινικές δοκιμές

Η κλινική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας αποδείχτηκε πολύ πιο δύσκολη από όσο αρχικά αναμενόταν, κυρίως λόγω της αναποτελεσματικότητας των διαθέσιμων συστημάτων γονιδιακής μεταφοράς (φορέων). Μόλις το 2000 όταν ανακοινώθηκε η πρώτη εξαιρετική επιτυχία: η μακροχρόνια διόρθωση του φαινοτύπου - ουσιαστικά η ίαση - ασθενών με σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), ένα κληρονομικό θανατηφόρο νόσημα, μέσω γονιδιακής θεραπείας. Όμως τα επόμενα δύο-τρία χρόνια, η γονιδιακή θεραπεία δέχτηκε ισχυρά χτυπήματα: πρώτον η ανάπτυξη οξείας λευχαιμίας σε δύο παιδιά με SCID ως άμεση συνέπεια της γονιδιακής μεταφοράς με ρετροϊικό φορέα σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα και δεύτερον, ο θάνατος ενός 18χρονου που έπασχε από έλλειψη της τρανσκαρβαμυλάσης της ορνιθίνης εξαιτίας αλλεργικής αντίδρασης που προκλήθηκε από τη χορήγηση ενός αδενοϊικού φορέα. Οι εξελίξεις αυτές ανέδειξαν ότι ο περιοριστικός παράγοντας στην επιτυχή εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας σήμερα είναι η έλλειψη φορέων που να χαρακτηρίζονται από αποτελεσματικότητα αλλά και ασφάλεια, γεγονός που χαρακτηρίστηκε ως “Αχίλλειος πτέρνα” της γονιδιακήςθεραπείας. Παρακάτω δίδονται παραδείγματα ασθενειών στις οποίες έχουν γίνει κλινικές δοκιμές, από το: Journal of Gene Medicine Clinical Trial Database: http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical Παρά τα όποια προβλήματα, η γονιδιακή θεραπεία αποτελεί μια καινοτόμο θεραπευτική προσέγγιση που φέρει την προσδοκία αντιμετώπισης ασθενειών για τις οποίες δεν υπάρχει αποτελεσματική συμβατική θεραπεία. Στη σημερινή κρίσιμη καμπή στην ιστορία της, η έρευνα προς την αναζήτηση και αξιολόγηση νέων φορέων γονιδιακής μεταφοράς είναι περισσότερο επίκαιρη από ποτέ.

Σημείωση: Τα σχήματα προέρχονται από τη διδακτορική διατριβή της Ειρήνης Παπαπέτρου, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών, 2006.